導(dǎo)  語

1. 參與者特征

表 1 展示了 276 名重度哮喘患者和 62 名提供優(yōu)質(zhì)痰樣本的健康對(duì)照者的特征。98 名重度哮喘患者在 1 年后返回并提供了另一份痰樣本。與健康對(duì)照者相比，重度哮喘參與者年齡更大、體重更重、氣流阻塞更嚴(yán)重，呼出的一氧化氮水平更高，血液和痰中的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)也更高。1 年后返回的患者與整個(gè)重度哮喘組的特征相似。

表1 健康對(duì)照組和重度哮喘患者的特點(diǎn)

2. 與補(bǔ)體激活相關(guān)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白

研究人員通過加權(quán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析對(duì) 436 份痰樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜進(jìn)行研究，得到 7 個(gè)模塊并分析了它們之間的相關(guān)性。其中棕色模塊與病情加重及嗜酸性粒細(xì)胞炎癥標(biāo)志物顯著相關(guān)，其包含的蛋白質(zhì)主要參與補(bǔ)體激活、凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等通路，且相互作用網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步確定了補(bǔ)體相關(guān)蛋白（C2、C5、C1QB、C1QC、C1R、CFI、CFH）是棕色模塊的核心蛋白（圖 S1d），這為揭示補(bǔ)體系統(tǒng)與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥在重度哮喘中的關(guān)聯(lián)提供了重要依據(jù)。

圖1 識(shí)別與臨床、生理和炎癥指標(biāo)相關(guān)的模塊，以及這些模塊中的基因所涉及的通路和生物學(xué)功能。

3. 補(bǔ)體C5通路蛋白與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥呈正相關(guān)

差異蛋白表達(dá)分析表明，與健康對(duì)照者相比，重度哮喘患者在基線和隨訪期間的蛋白上調(diào)主要以嗜酸性粒細(xì)胞顆粒酶為特征，還包括黏液成分 MUC5AC（圖S2a、b）。此外補(bǔ)體通路的核心蛋白C5在重度哮喘組中的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，而C3則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 2a、b）。根據(jù)痰嗜酸性粒細(xì)胞水平進(jìn)行分類，C3的表達(dá)在各組間無顯著差異（圖 2c）。然而嗜酸性粒細(xì)胞高水平組的C5表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而嗜酸性粒細(xì)胞低水平組與對(duì)照組之間無顯著差異（圖 2d）。C5 下游通路蛋白（C6、C7、C8B、C8G、C9）在嗜酸性粒細(xì)胞高水平組中也顯著上調(diào)（圖 S2c）。此外在重度哮喘組中，C5 的表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵指標(biāo)呈正相關(guān)，包括誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞、呼出氣一氧化氮分?jǐn)?shù)（FeNO）以及血液中嗜酸性粒細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分比（圖 2e）。除補(bǔ)體 C5 通路外，凝血相關(guān)蛋白包括 F2（凝血因子 II）、F12（凝血因子 XII）和 PLG（纖溶酶原）在嗜酸性粒細(xì)胞高水平組中也上調(diào)（圖 S3）。

4.一年后的補(bǔ)體C5表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞顆粒介質(zhì)及炎癥相關(guān)

為探究補(bǔ)體C5對(duì)重度哮喘嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的影響，研究人員根據(jù)基線和一年縱向隨訪時(shí)相關(guān)指標(biāo)的變化進(jìn)行了相關(guān)性分析，第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV?% predicted）的變化與C5的變化呈負(fù)相關(guān)（圖3a）。 嗜酸性粒細(xì)胞衍生神經(jīng)毒素（RNASE2）的變化、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（RNASE3）的變化、嗜酸性粒細(xì)胞顆粒主要堿性蛋白（PRG2）的變化以及嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶（EPX）的變化均與C5的變化呈正相關(guān)（圖3b-e），此外痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比的變化、血液嗜酸性粒細(xì)胞百分比的變化以及血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化也與C5的變化呈明顯正相關(guān)（圖3f-h）。根據(jù)基線和一年后補(bǔ)體C5表達(dá)的差異，將患者分為C5升高組（上調(diào)組）和C5降低組（下調(diào)組）。下調(diào)組的FEV?% predicted高于上調(diào)組（圖S4a）。下調(diào)組的RNASE2、PRG2和EPX的表達(dá)顯著低于上調(diào)組（圖S4b-e）。此外，下調(diào)組的痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比和血液嗜酸性粒細(xì)胞百分比也低于上調(diào)組（圖S4f-h）。 

5.單細(xì)胞RNA測序識(shí)別表達(dá)補(bǔ)體C5及其受體的細(xì)胞類型

對(duì)4名痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比超過3%的重度嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘患者（5個(gè)樣本：3個(gè)僅含支氣管肺泡灌洗液（BALF），1個(gè)含支氣管肺泡灌洗液和支氣管黏膜活檢樣本）以及來自已發(fā)表數(shù)據(jù)庫的4名健康對(duì)照者的支氣管肺泡灌洗液數(shù)據(jù)進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾和批次校正（圖S5a、b）后，識(shí)別出10種主要細(xì)胞類型，包括巨噬細(xì)胞、循環(huán)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞（包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）和肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞（包括基底細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞）（圖4a、b）。 與健康對(duì)照者相比，重度哮喘患者的C5、C5aR1和C5aR2表達(dá)增加（圖4c）。補(bǔ)體C5主要在巨噬細(xì)胞亞群中表達(dá)（圖4d），而其受體C5aR1在多種細(xì)胞類型中表達(dá)更廣泛，包括嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞（圖4e），但嗜酸性粒細(xì)胞中C5受體C5aR2的表達(dá)最高（圖4f）?；蚣u(píng)分分析顯示，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路在巨噬細(xì)胞中高度富集（圖S5c、d）。支氣管活檢的免疫熒光染色顯示，與慢性咳嗽對(duì)照者相比，哮喘患者中表達(dá)補(bǔ)體C5的巨噬細(xì)胞百分比顯著更高（圖S5e）。哮喘組巨噬細(xì)胞（圖S5f）和嗜酸性粒細(xì)胞（圖4g）中補(bǔ)體受體C5aR（C5aR1）的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而表達(dá)C5aR的中性粒細(xì)胞百分比無差異（圖S5g）。

6.補(bǔ)體C5在激素抵抗性哮喘小鼠模型中促進(jìn)炎癥反應(yīng)

研究人員采用屋塵螨（HDM）聯(lián)合低劑量脂多糖（LPS）刺激的激素抵抗性哮喘小鼠模型（每組5只）來模擬重度哮喘（圖S6a）。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)通過鼻內(nèi)給予重組C5會(huì)增強(qiáng)小鼠對(duì)乙酰膽堿的氣道反應(yīng)性，增加支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞、Th2細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的數(shù)量，提高相關(guān)細(xì)胞因子水平，而抗C5抗體可逆轉(zhuǎn)這些變化，減輕炎癥浸潤和杯狀細(xì)胞化生。這表明內(nèi)源性C5在哮喘模型的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥中起作用，中和C5可緩解相關(guān)病理反應(yīng)。

7.補(bǔ)體C5通過激活I(lǐng)L-5轉(zhuǎn)基因小鼠中的嗜酸性粒細(xì)胞加劇嗜酸性粒細(xì)胞炎癥

在IL-5轉(zhuǎn)基因小鼠中，C5通過激活嗜酸性粒細(xì)胞加劇嗜酸性粒細(xì)胞炎癥給IL-5轉(zhuǎn)基因小鼠每2天經(jīng)鼻滴注重組補(bǔ)體C5蛋白或磷酸鹽緩沖液（PBS），持續(xù)2周（圖6a和圖S7）。與單獨(dú)給予PBS相比，給予C5會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿激發(fā)引起的基線氣道阻力增加（圖6b），支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多（圖6c、d），以及支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞顆粒酶（包括嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶（EPX）和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP））水平升高（圖6e、f）。肺組織的組織病理學(xué)檢查證實(shí)，給予C5的小鼠存在支氣管炎癥（圖6g）和杯狀細(xì)胞化生（圖6h）。使用C5aR1拮抗劑（PMX-53）進(jìn)一步評(píng)估C5的作用，將其與重組C5共同給予小鼠（圖S8a）。C5aR1拮抗作用顯著降低了對(duì)乙酰膽堿（ACh）激發(fā)的氣道阻力（圖S8b），減少了支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤（圖S8c），降低了EPX（圖S8d）和ECP（圖S8e）的表達(dá)，并減輕了肺組織學(xué)中的炎癥變化（圖S8f）。使用C5aR1拮抗劑還導(dǎo)致碘酸雪夫染色陽性細(xì)胞減少，表明杯狀細(xì)胞化生減少（圖S8f）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在該模型中C5會(huì)加劇嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，而C5aR1拮抗作用可有效減輕C5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。